Im Januar 1939 wurde die Produktion der Bf 109 auf die neue Version E-1 umgestellt. Nachdem sich der weniger zuverlässige Vergasermotor DB 600 als Enttäuschung herausgestellt hatte, kam bei der E-1 der leistungsfähigere Einspritzmotor DB 601 zum Einsatz, damals einer der weltweit modernsten Flugmotoren überhaupt. Erprobt in den Prototypen V14 und V15, lieferte der, mit einer Benzindirekteinspritzung von Bosch ausgestattete, DB 601 A-1 eine Startleistung von etwa 990 PS. Ab Frühjahr 1939 ersetzte die Bf 109 E-1 die älteren B- und C-Modelle. Die Umstellung war im Herbst 1939 abgeschlossen.

Äußerlich zeichnete sich die „Emil“ durch eine völlig überarbeitete Motorabdeckung aus. Der charakteristische Kinnkühler wurde stark verkleinert und beherbergte nunmehr nur noch den Ölkühler. Die beiden Kühler für das Glykol-Wasser-Gemisch wurden in flachen Gehäusen unterhalb der Tragflächen untergebracht. Insgesamt verbesserte sich dadurch die aerodynamische Linienführung, was zusammen mit dem stärkeren Motor zu einem sprunghaften Leistungsanstieg führte. War die E-1 zunächst noch mit derselben Bewaffnung ausgestattet wie ihre Vorgänger (4 × 7,92-mm-MG 17), gelang es bei der Bf 109 E-3, die Ende 1939 zum Einsatz kam, schließlich, diese durch den Einbau von tragflächenmontierten Maschinenkanonen erheblich zu verstärken. Der Versuch, eine zentrale Kanone hinter dem Motor zu installieren, war zuvor mit der Version E-2 erneut fehlgeschlagen. Bei den Tragflächenkanonen handelte es sich um Waffen des Typs 20 mm MG FF, die aus der Schweizer 20-mm-Kanone der Maschinenfabrik Oerlikon abgeleitet worden war. Die Waffen schossen unsynchronisiert außerhalb des Propellerkreises und wurden durch ein Trommelmagazin mit je 60 Schuss pro Kanone bevorratet. Dies war vergleichsweise wenig und gerade ausreichend für einen Feuerstoß von etwa zehn Sekunden. Zudem hatte die Kanone mit ihrem kurzen Lauf und der geringen Mündungsgeschwindigkeit der Geschosse eine schlechtere Ballistik aufzuweisen als die Maschinengewehre MG 17. Diese Nachteile wurden durch die Verfügbarkeit von Sprengmunition (ab der E-4 auch hochwirksame Minenmunition mit Zerlegerzünder) wieder ausgeglichen.

Die E-Serie war die erste Ausführung der Bf 109, die nicht nur in großem Umfang an die Jagdeinheiten der Luftwaffe, sondern auch an ausländische Nutzer abgegeben wurde. Die Schweiz hatte im Winter 1938/39 bereits zehn Bf 109 D mit Junkers-Motoren importiert und bestellte im Anschluss insgesamt 30 Bf 109 E-1. Nach der Ankunft der ersten Maschinen wurde dieser Auftrag sogar auf 50 Maschinen erhöht. Auch nach Jugoslawien gingen Flugzeuge dieser Ausführung.

Die Produktion der Bf 109 wurde mit der E-Serie erheblich ausgeweitet und erreichte mit 1100 gebauten Maschinen in den ersten acht Monaten des Jahres 1939 einen neuen Höchststand. Auch diese Variante wurde noch in Spanien erprobt und als der Zweite Weltkrieg mit dem deutschen Polenfeldzug begann, stellte die Bf 109 E bereits den überwiegenden Teil der deutschen Jagdeinheiten. So waren von den 320 am Polenfeldzug beteiligten einsatzklaren Bf 109 ganze 213 aus der E-Serie. Im Einsatz erwies sich die Bf 109 E über Polen, Norwegen und Frankreich als äußerst gutes Jagdflugzeug, das zudem von gut ausgebildeten Piloten geflogen wurde. Der Nachteil der geringen Reichweite fiel bei den frühen Feldzügen der Wehrmacht noch wenig ins Gewicht. Erst während der Luftschlacht um England, als die deutschen Jagdgeschwader zum ersten Mal in großem Stil auf gleichwertige Gegner trafen (sowohl in technischer, als auch – mit gewisser zeitlicher Verzögerung – in Hinblick auf den Ausbildungsstand), traten die Stärken und die Schwächen der Bf 109 E deutlicher zu Tage.

In mittleren und großen Höhen war die Bf 109 E schneller als die britische Spitfire und in allen Höhen deutlich schneller als die Hurricane. Dieser Höhenvorteil konnte von den deutschen Piloten immer wieder genutzt werden, wenn sie sich bei Begleiteinsätzen aus überhöhten Positionen auf die, die deutschen Bomber angreifenden, britischen Jäger stürzen konnten. Mit einer Bewaffnung von zwei 20-mm-Kanonen vom Typ MG FF und zwei 7,92-mm-Maschinengewehren vom Typ MG 17 verfügte sie außerdem über eine größere Feuerkraft als die britischen Jäger mit ihrer Batterie von acht 7,7-mm-MGs – hauptsächlich bedingt durch die Sprengmunition der Maschinenkanonen.

Gegenüber den britischen Jägern, Spitfire und Hurricane, besaß die Bf 109 E einen größeren Wendekreis. Zwar wies sie einen höheren Auftriebsbeiwert und ein geringeres Gewicht auf als die Spitfire, aber aufgrund ihrer deutlich kleineren Tragfläche hatte sie bei gleicher Geschwindigkeit trotzdem einen etwa 20 % größeren Wendekreis. Hinsichtlich der Sturzgeschwindigkeit übertraf die Bf 109 E beide britischen Muster.

Ein weiterer Vorteil der Bf 109 E war der Daimler-Benz-Motor mit direkter Benzineinspritzung, der es erlaubte, hart in einen Sturzflug zu drücken, ohne dass der Motor aussetzte (Defensivmanöver in der Luftkampftaktik). Die britischen Flugzeuge mit Vergasermotoren mussten den Sturzflug mit einer zeitraubenden halben Rolle einleiten und konnten daher nicht schnell genug folgen. Der größte Nachteil der Bf 109 E zum Zeitpunkt der „Luftschlacht um England“ bestand in ihrer geringen Reichweite. Bei Begleiteinsätzen hatten die deutschen Piloten über ihren Zielen oft nur genügend Benzin für 10 bis maximal 20 Minuten Luftkampf und oft die Wahl, die Bomber im Stich zu lassen oder eine Notwasserung im Ärmelkanal wegen Treibstoffmangels zu riskieren. Die Entwicklung der E-Serie hatte vor Beginn der Luftkämpfe über England mit der Version E-4 zwar eine neue, vereinfachte Cockpithaube mit verbesserter Panzerung gebracht, doch die dringend notwendige Einführung eines Zusatztanks konnte vor dem Ende der Luftschlacht um England nicht mehr abgeschlossen werden. Dies gelang erst im Herbst 1940 mit der Version E-7.

Nach der Luftschlacht um England fand die E-Serie der Bf 109 Einsatz in immer neuen Rollen. Neben den Aufklärervarianten E-5 und E-6 wurde mit der Bf 109 E-4/B ein Jagdbomber entwickelt, mit dem die Jagdgeschwader „Hit and run“-Einsätze gegen wichtige Punktziele an der englischen Südküste fliegen konnten. Diese Variante wurde auch in einigen Staffeln der Zerstörergeschwader eingeführt, deren Maschinen vom Typ Bf 110 sich verwundbar gegenüber Jägerangriffen gezeigt hatten. Maschinen des Typs Bf 109 E-4/B wurden zudem vom Lehrgeschwader 2 mehrfach erfolgreich bei Angriffen auf Schiffe eingesetzt.

Mit der Version E-7 wurde im Herbst 1940 nicht nur die Möglichkeit der Mitführung von Zusatztanks, sondern zusätzlich eine aerodynamisch überarbeitete Propellerhaube eingeführt, da man zumindest für die E-Serie nach den schlechten Erfahrungen mit der E-2 auf die Option einer Motorkanone endgültig verzichtet hatte. Als die deutsche Wehrmacht ab Februar 1941 Truppen nach Nordafrika schickte, gehörten in erster Linie Bf 109 E-4/Trop und E-7/Trop mit Sandfiltern zur Ausstattung der dem Afrikakorps zugeordneten Jagd- und Jagdbomberverbände. Dort und einige Monate später während des Angriffs auf die Sowjetunion zeigte sich die Bf 109 E, deren Zeit langsam zu Ende ging, noch einmal allen Gegnern gewachsen, die gegen sie aufgeboten wurden. Die letzten Versionen der E-Serie wurden schließlich noch bis weit in das Jahr 1943 bei Einsatzverbänden geflogen, hauptsächlich als Schlachtflieger und Aufklärer.